一．服务内容

我公司提供的单细胞建库测序技术服务是针对大规模细胞群体进行表达谱分析，具体服务内容是利用10x Genomics微流控凝胶微珠技术对细胞悬液样本中的500~10,000个单细胞进行捕获标记，同时对每个标记了的细胞中的RNA分子进行独立标记，建成用于illumina测序平台的转录组测序文库。建成的文库将在illumina NGS测序平台上进行测序。最终利用10x Genomics的Cell Ranger对测序的结果进行解码，并针对单个细胞的表达谱差异对样本细胞群进行细胞亚群分析。

二．实验操作步骤概述

1. 对单细胞悬浮液样本进行10x Genomics上机，制备油包水微滴乳浊液（GEMS）。

2. 油包水微滴乳浊液上PCR仪，进行逆转录操作。

3. 破乳后进行cDNA的回收、纯化和扩增等操作。

4. 进行片段化，末端修复，加A、加接头，Sample Index PCR等后续文库构建操作。

三．实验结果

我公司完成10x Genomics建库技术服务的过程中提供2个结果，分别是文库质检结果报告和测序结果分析报告。

四．样品要求及注意事项

1. 接收的样品为单细胞悬液，如需组织解离，细胞分选等样品制备需由客户自行完成。

2. 单细胞悬液中，细胞间无粘连，无大于40uM的细胞碎片或其他颗粒物），单细胞悬液上样前需过40uM细胞滤网（如Falcon cell strainer, REF 352340），确保不会堵塞微流控通道。

3. 细胞悬液中单细胞个数应大于预期实测细胞个数的2倍，如预期测到500个单细胞的数据，应提供至少1000个单细胞。

4. 细胞成活率应大于85%（用台盼蓝染色检测）。

5. 上机单细胞悬液体积应小于30ul，建议细胞悬液浓度大约为1000个细胞/ul。

6. 如一次性上机多个样品，第一个样品制备完成到最后一个样品制备完成时间相差不超过1个小时。

五．服务验收标准

在细胞样品达到上述要求的前提下，结果达到如下标准：

1.测序文库合格：文库检测为单峰，且浓度高于3nM，体积大于25ul。

2.细胞捕获效率达到50%：最终测序数据结果中的细胞数达到50%的起始细胞数。

六．服务承诺

1. 对于达到样本要求的实验，由于细胞计数误差等实验中存在的不确定性，实验结果在上述标准的±20%以内都为可以接受的范围。如果结果在验收标准20%以下的（即捕获效率低于40%）可判定实验失败，公司将承担该样本的试剂耗材及服务费等全部费用。

2. 如果实验过程中确认试剂耗材质量的问题，我公司负责向10x Genomics厂家申请赔付。（通过其它渠道采购的试剂耗材，我们也将协助客户完成索赔）

3. 如果细胞样品未达到要求，客户可以选择重新送样或风险上机，风险上机将不能按照上述标准验收。

七．常见问题解答

1. 10x Genomics厂家的捕获成功标准是65%，为什么贵公司承诺只有50%？

答：厂家测试捕获效率用的是细胞系，细胞系样品很容易制备成单细胞悬液，且能保证较高的细胞活性和完整性，而服务项目客户很少用细胞系，大部分是用组织解离制备的细胞悬液，其细胞成活率相对较低，而且细胞计数的方法也会给结果造成一定偏差，因此我们把标准定在50%。

2. 建好的文库送给测序公司上机前，文库质检达不到测序公司的合格标准怎么办？

答：测序公司出于免责的考虑，对客户自建的文库质检标准会比较严格，因此有可能我们库检没问题的样品测序公司会判定为不合格。请把测序公司的文库质检结果发送刘元和牛松，我们根据质检结果判定是否应承担测序上机风险。

3. 如果实验失败了，贵公司如何赔偿？

答：两种情况，一是如果因10x芯片或试剂导致实验失败，我们负责联系厂家索赔，服务项目就更换试剂耗材重新做实验。二是客户细胞样品合格、非风险上机情况下建库失败，就不收取费用。实验过程中的问题，我们和客户应本着互信原则协商解决，实验失败我们不对客户细胞样品进行赔偿。

4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger进行的标准分析外，贵公司还能提供哪些分析？

答： 基本分析 

 ⑴ 提取测序序列 将bcl文件转化为fastq，生成后期的样本index序列文件，UMI序列及MRNA序列。

 ⑵ 序列比对注释 将序列比对到相应的参考基因组的基因区域。

 ⑶ 按照细胞和基因组信息统计UMI，barcode信息，计算细胞和基因表达矩阵。

   其他高级分析

 ⑴ t-SNE降维分析及聚类：利用T分布随机相邻嵌入法(t-SNE)对数据降维处理，基于2维数据展示。利用聚类算法对细胞进行聚类分析，聚类后的细胞群体之间进行差异表达分析。

 ⑵ 基因的富集分析：差异基因进行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。