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Twist NGS
Twist 人核心外显子组试剂盒:提高靶向测序的成本效益、质量和灵活性


近年来,外显子组测序在转化医学和临床研究中越来越普及。外显子组定义和文库制备试剂盒多方位发展,旨在支持各种各样的应用。目前市面上的外显子组试剂盒受到设计方法、合成技术和工作流程严密性的限制,最终可能引入区域特异性偏好和不均一性。这会导致效率低下,需要通过过度测序进行弥补,从而很难降低成本。Twist 人核心外显子组试剂盒通过平衡设计特异性、靶标覆盖率、中靶率、优化的杂交和富集条件等多种富集参数,提升了整体性能效率,最终获得高度均一、高度优化的捕获解决方案,能够满足多种应用需求。

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外显子组设计和探针合成

Twist 人核心外显子组试剂盒选择基于 CCDS 的高度保守的蛋白编码区域作为靶标。然后根据靶标设计 120 nt 的探针。再利用 Twist Bioscience 专有的硅基技术合成探针,同时扩增探针并在5'端添加生物素标记。探针的设计和扩增过程经过迭代优化,能尽量降低各种因素的影响以防引起探针偏好,最终得到严格控制的探针占比,从而确保目标序列的两条链都可以被捕获。接着通过 NGS 评估最终探针池的探针占比和均一性—— NGS 是 Twist Bioscience NGS 靶向富集方案中特有的质量控制步骤。

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图 1. 使用 NGS 对探针进行质量控制。探针平铺覆盖整个靶向编码区域。将测序片段重新定位到目标区域,验证探针合成的准确性。

灵活性不受限制

Twist Bioscience 外显子组由一个灵活的捕获前多样本混合工作流程提供支持,该工作流程仅需 50ng 的 DNA 起始量,可提供从文库复杂度、靶向覆盖度到最终变异识别的灵敏度和准确性与 1-Plex 捕获一致的高质量数据,这些高质量的数据可以最大限度减少测序要求,从而提高工作流程效率。

以最小捕获量获得出色的临床相关突变覆盖度

比较 Twist 人核心外显子组试剂盒与市面上多款其它外显子组设计产品,结果表明,尽管 Twist 人核心外显子组试剂盒设计的捕获区域最小,但其对 38,638 个突变的覆盖率高达 99%,因此能提高捕获效率,减少每个文库的前期测序要求(图 2)。

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图 2. Twist 人核心外显子组与其它商用外显子组对比,比较结果基于所含靶标及其突变覆盖率。

以最小的测序量实现深度靶标覆盖

在同等测序条件下,与竞争对手 1 相比,Twist 人核心外显子组试剂盒覆盖的测序深度在 30x 或以上的靶标数量多 7%,富集性能高 8%(图 3)。

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图 3. 基于覆盖度、中靶率和 Fold-80 碱基罚分的外显子组性能。

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图 4. 覆盖图显示,与竞争对手相比,Twist 的外显子组解决方案所生成的数据具有更高均一性。阴影区域表示测序不足和过度测序的区域,这些区域通常会分别导致突变缺失或测序成本增加。

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图 5. 测序片段计数 vs. 以 GC 含量分箱 (bin) 的靶标绘制的热图进一步显示,与竞争对手相比,Twist 外显子组的数据具有更高的均一性。

高灵敏度、高精确度的变异识别,确保变异检测的可信度

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通过与 GIAB 发布的高置信度 NA12878 突变位点进行比对,相对于竞争对手 1 外显子组,Twist 检测插入缺失的性能有所提升。

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通过分析测序深度为 20x 或以下的靶标区域,进一步评估变异识别性能。使用 Twist 人核心外显子组试剂盒进行富集后,97.76% 以上的区域测序深度大于 20x,94% 以上的区域测序深度大于 30x。大幅减少了需要通过 Sanger 测序进行验证的区域。





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